Standardization of 3D Spheroid Generation and Mass Density Profiling: Development of a Biofluidic Instrument and Application to Ovine Trophoblast Models

The overarching goal of this doctoral project is to establish a complete and coherent technological and biological pipeline for the generation, preservation, and biophysical characterization of three-dimensional (3D) cellular models relevant to veterinary science. This work moves from material design to biological application, integrating agarose-based microstructured scaffolds, short-term preservation strategies, and novel microfluidic technologies to create a unified framework capable of producing robust, transportable, and quantifiable 3D cell systems. To achieve this, the project focuses first on the development and optimization of agarose-based platforms designed to generate controlled and reproducible spheroids across multiple cell types by exploiting tailored microarchitectures and defined biomechanical properties. Building upon this foundation, the work seeks to establish a short-term transport methodology centered on agarose, capable of maintaining the structural and functional integrity of living spheroids for 24–72 hours without the use of cryoprotectants, thereby enabling reliable inter-laboratory exchange of viable 3D cultures. In parallel, the project aims to investigate cellular mass density as a quantitative biophysical marker that reflects viability, metabolic state, and structural organization within 3D models. This includes laying the groundwork for density-driven analytical approaches in veterinary cell biology. To support such analyses, a new microfluidic-based instrument for label-free mass density measurement is designed, built, and validated, addressing the limitations of existing commercial systems and expanding analytical capabilities. Finally, the technologies developed throughout this project are applied to ovine reproductive models including trophoblast-derived spheroids and oocytes to demonstrate their biological relevance, sensitivity, and translational value. Together, these objectives define a research trajectory that unifies material engineering, microfluidics, and veterinary cell biology into a single methodological ecosystem. The outcome is a validated set of tools and concepts enabling reproducible production, short-term preservation, and biophysical assessment of 3D cellular systems, advancing both technological innovation and biological understanding in the field.

L'obiettivo generale di questo progetto di dottorato è stabilire una pipeline tecnologica e biologica completa e coerente per la generazione, la preservazione e la caratterizzazione biofisica di modelli cellulari tridimensionali (3D) di interesse per le scienze veterinarie. Questo lavoro si muove dal design dei materiali all'applicazione biologica, integrando scaffold microstrutturati a base di agarosio, strategie di conservazione a breve termine e innovative tecnologie microfluidiche per creare un framework unificato in grado di produrre sistemi cellulari 3D robusti, trasportabili e quantificabili. Per raggiungere questo scopo, il progetto si concentra innanzitutto sullo sviluppo e l'ottimizzazione di piattaforme a base di agarosio progettate per generare sferoidi controllati e riproducibili da molteplici tipi cellulari, sfruttando microarchitetture dedicate e proprietà biomeccaniche definite. Sulla base di queste fondamenta, il lavoro mira a stabilire una metodologia di trasporto a breve termine incentrata sull'agarosio, capace di mantenere l'integrità strutturale e funzionale di sferoidi vivi per 24-72 ore senza l'uso di crioprotettori, consentendo così uno scambio inter-laboratorio affidabile di colture 3D vitali. In parallelo, il progetto si propone di studiare la densità di massa cellulare come marcatore biofisico quantitativo che riflette la vitalità, lo stato metabolico e l'organizzazione strutturale all'interno dei modelli 3D. Ciò include il porre le basi per approcci analitici basati sulla densità nella biologia cellulare veterinaria. Per supportare tali analisi, viene progettato, costruito e validato un nuovo strumento su base microfluidica per la misurazione della densità di massa label-free, superando i limiti dei sistemi commerciali esistenti ed espandendo le capacità analitiche. Infine, le tecnologie sviluppate nel corso di questo progetto vengono applicate a modelli riproduttivi ovini inclusi sferoidi derivati da trofoblasto e oociti per dimostrarne la rilevanza biologica, la sensibilità e il valore traslazionale. Insieme, questi obiettivi definiscono una traiettoria di ricerca che unisce l'ingegneria dei materiali, la microfluidica e la biologia cellulare veterinaria in un unico ecosistema metodologico. Il risultato è un insieme validato di strumenti e concetti che consentono la produzione riproducibile, la conservazione a breve termine e la valutazione biofisica di sistemi cellulari 3D, facendo avanzare sia l'innovazione tecnologica che la comprensione biologica nel settore.